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CRISPR三類系統(tǒng)的詳細解讀

目前自然界中，發(fā)現(xiàn)的CRISPR-Cas系統(tǒng)共分為三類：I， II 和III類，我們現(xiàn)在用的最常見的Cas9屬于II類，今天我們就系統(tǒng)的和大家聊一下：

實際上，在每個大類內(nèi)部，根據(jù)不同的分類原則，共計分為10個小類（圖1）。三大類中的不同種類Cas蛋白的功能，決定了每一類擁有不同降解外源基因組的機制。

圖1. 不同物種中，根據(jù)Cas蛋白的不同，將整個CRISPR系統(tǒng)分為3大類，10小類。I類的標(biāo)記基因是Cas3（紫色）；II類的標(biāo)記基因是Cas9（褐色）；III類的標(biāo)記基因是Cas10（藍色）。

共同點：

Cas1基因編碼一種金屬依賴的DNA酶，這種酶無序列特異性，其功能是參與外源基因的spacer整合到CRISPR盒子中（CRISPR cassettes）；

Cas2基因編碼一種金屬依賴的核糖核酸內(nèi)切酶，其功能是參與Spacer的獲得；

這些共同點決定了，擁有CRISPR系統(tǒng)的物種，獲取外源spacer的機制是一致的（圖2）。

不同點：

區(qū)分三類的標(biāo)簽基因（signature gene）：

I 類： Cas3基因，屬于解旋酶家族成員；

II 類：Cas9基因，含有核酸酶的2個結(jié)構(gòu)域： RuvC 和 HNH；

III 類：Cas10基因，其具有和核酸聚合酶以及核酸環(huán)化酶同源的結(jié)構(gòu)域；

下面詳細講解下這三類CRISPR系統(tǒng)：

I 型CRISPR

I 型CRISPR的標(biāo)簽基因是Cas3（紫色）。在不同的物種中，又將I 型細分為6個亞型（I-A-E），圖3。

圖3. I 型CRISPR的六個亞型

I 型CRISPR包含8個Cas基因：Cas3,Cse1, Cse2, Cas7, Cas5, Cas6e, Cas1, and Cas2。其中，除了Cas3，其余的Cas基因都位于同一個啟動子后面，這即是我們在大學(xué)時考分子生物時經(jīng)?？嫉降囊粋€名詞解釋：多順反子?！鞠氲矫~解釋，當(dāng)年是多么痛苦？關(guān)鍵還要英文描述……】

圖4. I 型CRISPR的機制

在表達階段（圖4. a），I 型會產(chǎn)生三個部分：Cas3，Cascade（Cse1, Cse2,Cas7, Cas5和Cas6e的復(fù)合物）和pre-crRNA。Pre-crRNA通過Cascade中的Cas6e來剪切加工獲得成熟的crRNA，并和Cascade繼續(xù)形成復(fù)合物狀態(tài)。

在降解階段（圖4. b），成熟crRNA和Cascade形成的復(fù)合物在外源基因上找到和crRNA匹配的位點后，則形成了R型的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，Cascade構(gòu)象改變，招募Cas3，由Cas3內(nèi)切酶行使剪切外源基因的功能。

我們常用的E.coli就屬于I 型，不過要注意的是，并不是每種細菌都只有一種類型的CRISPR，有部分細菌同時擁有三種類型，有的擁有兩種，想必這個也是進化的結(jié)果。不過，病毒等外源“侵略者”也不是好欺負的，通過M13噬菌體侵染E.coli實驗，發(fā)現(xiàn)有的噬菌體并沒有被干掉，原因是其基因組中和crRNA想對應(yīng)的基因發(fā)生了點突變，這就是所謂的“免疫逃逸”，正所謂，道高一尺魔高一丈！

II 型CRISPR

如前所述，II 型CRISPR系統(tǒng)有2個亞型：II-A和II-B（圖5）。兩者的區(qū)別在于II-A包含有csn2基因，而II-B包含的是csn4基因。關(guān)于csn2和csn4基因的功能，目前認為其參與了外源基因組spacer的獲取等功能。

圖5. II 型CRISPR系統(tǒng)的兩種亞型

目前，研究比較深入的是II-A，它也有2種：一種是長的Cas9基因和短的csn2基因，另外一種是短的Cas9基因和長的csn2基因，另外，兩tracrRNA的位置也不一樣（圖6）。

【現(xiàn)在常用的Cas9是長片段的，為什么沒有人做短片段的？張峰后來做的saCas9是否是短的？等有時間再明確下，有知道的麻煩回復(fù)我】

圖6. 兩種 II-A型CRISPR基因結(jié)構(gòu)圖

（紅色的*代表tracrRNA。tracrRNA所處的位置不一樣）

II型CRISPR在清除外源基因過程中，不同于I型CRISPR，有其特殊的機制。首先需要tracrRNA，其次需要體內(nèi)RNaseIII的參與（圖 7）。

圖7. II型CRISPR剪切機制

如果在用CRIPSR進行基因組編輯的朋友，對這個流程應(yīng)該比較熟悉，因為，我們現(xiàn)在常用的KO系統(tǒng)，就來源于II型CRISPR。大概的步驟如下（圖 7）：

tracrRNAs和pre-crRNA中的重復(fù)片段區(qū)域雜交，Cas9和crRNA-tracrRNA結(jié)合；
RNase III從spacer的5’端開始剪切，產(chǎn)生不同類型的成熟的crRNA-tracrRNA-Cas9的復(fù)合物；
第2步產(chǎn)生的復(fù)合物和相匹配的外源基因結(jié)合并剪切，這個過程需要PAM位點。

回顧 II 型CRISPR機制的發(fā)現(xiàn)過程，深深感覺，基礎(chǔ)研究積累到一定程度，在應(yīng)用上一定爆發(fā)。2007年開始，II 型CRISPR的機制被不斷完善的過程中，當(dāng)時，已經(jīng)有一些應(yīng)用方向，不過主要用在菌株鑒定和分型。同時，因為II 型CRISPR是在S. thermophilus中發(fā)現(xiàn)的，S. thermophilus是用來發(fā)酵酸奶和奶酪等益生菌產(chǎn)品的菌種，噬菌體污染是一個大問題，所以，研究人員就開始利用新發(fā)現(xiàn)的機制來指導(dǎo)開發(fā)更牛逼的對抗不同噬菌體的菌體，降低損失，提高產(chǎn)量。不過，研究菌的人，怎么也不會想到用它來開發(fā)基因組編輯工具，盡管現(xiàn)在看來似乎是很容易的一件事情。反而被搞晶體的Jennifer A. Doudna，搞遺傳的 George M Church和搞神經(jīng)生物學(xué)的Zhang Feng所采用并開發(fā)。因此，不同方向的交叉學(xué)習(xí)是多么重要？以后不光生命科學(xué)的報告，化學(xué)的，環(huán)境的，醫(yī)學(xué)的，電子工程的，材料的都應(yīng)該去聽聽……

III 型CRISPR

古細菌中，75%的類型是III 型CRISPR；而在細菌中，約40%。III 型CRISPR的標(biāo)簽基因是Cas10。III 型CRISPR又分為兩種亞型：III-A和III-B，其中III-A的標(biāo)簽基因是csm2，III-B的標(biāo)簽基因是cmr5（圖8）。

圖8. III 型CRISPR的兩種亞型，（a）為III-A，（b）為III-B。黃色為標(biāo)簽基因。

目前，很多種臨床中分離的致病菌屬于III 型CRISPR，比如S. epidermidis（葡萄球菌），其中的spacer可以抵抗外源的抗性質(zhì)粒以及病毒侵染。

不同于I和II型CRISPR系統(tǒng)，III 型CRISPR系統(tǒng)中，對于crRNA的加工經(jīng)過2個步驟：初始加工和成熟處理（圖9）。

圖9. PrecrRNA經(jīng)過初始加工后，分別形成獨立中間狀態(tài)的crRNA，之后經(jīng)過3‘端核酸酶的剪切，形成成熟的crRNA。

對中間狀態(tài)crRNA的加工，III-A和III-B的機制不太一樣。其中III-A亞型的加工，需要有剪切位點和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，加工需要的酶為：Cas6,Csm4, 和/或 Csm1等（圖10）；III-B的加工主要是由Cas6來執(zhí)行，Cas6形成二聚體和crRNA上游的重復(fù)序列結(jié)合（非發(fā)夾結(jié)構(gòu)，圖11）。