背景介紹：

細(xì)胞治療是近幾年興起的治療新技術(shù)，是指利用某些特定功能的細(xì)胞的特性，采用生物工程方法獲取或通過體外擴(kuò)增、特殊培養(yǎng)等處理后，產(chǎn)生的特異性功能強(qiáng)大的細(xì)胞，回輸體內(nèi)后，從而達(dá)到治療疾病的目的。

過繼性細(xì)胞治療已經(jīng)研究經(jīng)過十多年了，并且一直是研究的熱點(diǎn)。其中包括LAK，DC，CIK，DC-CIK，CAR-T，TCR-T，NK，CAR-NK，腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（TILs）等等。但是大浪淘沙，隨著研究的開展，能成功的治療方式并不多。其中CAR-T和TCR-T在研究中展現(xiàn)出出色的療效。而LAK，DC，CIK，DC-CIK基本被證明是無效的，或基本無效，雖然仍然有一些學(xué)者在艱苦研究DC相關(guān)的治療策略，但是目前未看到良好的成果。而NK/CAR-NK和Treg/CAR-Treg還處于早期研究，前路未明。

CAR-T技術(shù)（ChimericAntigen Receptor T-Cell，即T細(xì)胞嵌合抗原受體）通過基因工程手段修飾人的T細(xì)胞，使其表達(dá)嵌合抗原受體(chimeric  antigen recetor, CAR)，即將識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原的抗體與激活T細(xì)胞所需的信號(hào)分子連接，以此增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)腫瘤的特異性殺傷。

TCR-T細(xì)胞、CAR-T細(xì)胞與體內(nèi)正常T細(xì)胞一樣都是通過T細(xì)胞對(duì)特異性癌癥細(xì)胞抗原的識(shí)別能力和進(jìn)攻能力。TCR-T與CAR-T通過基因改造的手段提高T細(xì)胞受體對(duì)特異性癌癥細(xì)胞抗原的識(shí)別。因此也都統(tǒng)稱為“T細(xì)胞受體重新定向”技術(shù)（T cell receptor redirection）。但是CAR-T與TCR-T的抗原識(shí)別機(jī)制是完全不同的。TCR-T細(xì)胞與體內(nèi)的正常T細(xì)胞識(shí)別的抗原是需要通過MHC分子呈遞。而CART則利用能夠與特定抗原結(jié)合的抗體片段來識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的抗原。識(shí)別方式上的差異導(dǎo)致TCR-T和CAR-T在應(yīng)用領(lǐng)域有著相應(yīng)不同的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)。

至2016年以來，CAR-T行業(yè)的監(jiān)管政策層出不窮。政策主要是來自國家藥監(jiān)局和衛(wèi)健委兩個(gè)層面的。

2019年3月的《體細(xì)胞治療臨床研究和轉(zhuǎn)化應(yīng)用管理辦法》核心內(nèi)容是明確了醫(yī)療機(jī)構(gòu)作為責(zé)任主體，進(jìn)行體細(xì)胞治療等新技術(shù)的臨床研究，獲得安全有效性數(shù)據(jù)后，可以申請(qǐng)臨床應(yīng)用并收費(fèi)。但是個(gè)人覺得不必?fù)?dān)心行業(yè)再進(jìn)入出現(xiàn)“魏則西“事件的那個(gè)年代。中國醫(yī)療行業(yè)經(jīng)歷了這么多年的發(fā)展，監(jiān)管部門也已經(jīng)意識(shí)到了監(jiān)管的重要性。細(xì)胞質(zhì)量產(chǎn)品的開發(fā)是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要建立一整套體系才能達(dá)到穩(wěn)定的質(zhì)量控制，醫(yī)院是否能投入這一體系建設(shè)還要面臨很多現(xiàn)實(shí)的考慮。

小結(jié)：

FDA的監(jiān)管宗旨是以風(fēng)險(xiǎn)為導(dǎo)向的監(jiān)管體系，現(xiàn)在已經(jīng)明確以藥物監(jiān)管的方式來監(jiān)管CAR-T，中國實(shí)行雙軌制也是為了“提速”臨床，但根據(jù)美國發(fā)展來看未來依然是以藥物監(jiān)管為主導(dǎo)。

1.國際進(jìn)展：

2017年，美國批準(zhǔn)了兩款自體CAR-T產(chǎn)品，針對(duì)血液瘤，療效顯著，但復(fù)發(fā)率高，價(jià)格昂貴，當(dāng)前滲透率還較低。全球在研依然火熱，國內(nèi)臨床在研數(shù)量和美國持平。

2.國內(nèi)進(jìn)展：

國內(nèi)無產(chǎn)品上市，大概20幾家企業(yè)申報(bào)臨床，約30個(gè)產(chǎn)品，其中11個(gè)產(chǎn)品獲批臨床，國內(nèi)CAR-T研發(fā)特點(diǎn)：

1. 競爭激烈，同質(zhì)化嚴(yán)重；

2. 創(chuàng)新少，基本是模仿國外產(chǎn)品，缺少獨(dú)立IP；

3. 國內(nèi)企業(yè)在后期的生產(chǎn)工藝上較國外還是有差距，很多企業(yè)在正規(guī)的生產(chǎn)環(huán)節(jié)會(huì)遇到瓶頸。

3.CAR-T行業(yè)痛點(diǎn)：

1. 自體治療，費(fèi)用高，市場受限；

2. 血液瘤，市場天花板低，實(shí)體瘤問題沒解決；

3. 安全性問題大，復(fù)發(fā)率高。

4.未來發(fā)展趨勢(shì)：

1. 降低制備成本，比如從自體走向通用型；

2. 實(shí)體瘤攻克；

3. 提高安全性，降低復(fù)發(fā)率。

表1 CAR-T各個(gè)靶點(diǎn)國內(nèi)競爭情況

CAR-T在血液瘤上的成效是有目共睹的，在全球性ELIANA試驗(yàn)中，Kymriah治療后3個(gè)月的完全緩解率為83%，6個(gè)月的生存率為89%。ZUMA-1試驗(yàn)的初步分析顯示，惡性淋巴瘤患者接受YESCARTA單次輸注治療后，總緩解率為82%，完全緩解率為54%。中位隨訪8.7個(gè)月，44%的患者仍保持緩解，6個(gè)月的完全緩解率為47%。雖然CAR-T在血液瘤上大放異彩，但是在實(shí)體瘤的應(yīng)用上頻頻受限。對(duì)比血液瘤，在實(shí)體瘤上CAR-T應(yīng)用有如下難點(diǎn)。

1、實(shí)體瘤靶點(diǎn)選擇問題

第一，實(shí)體瘤靶點(diǎn)選擇問題。血液瘤靶點(diǎn)CD19會(huì)在所有的B細(xì)胞上表達(dá)卻不在其他組織和血液細(xì)胞中表達(dá)，血液中也未曾檢測(cè)到CD19可溶性蛋白的存在，CD19是B淋巴細(xì)胞白血病的一個(gè)非常理想的靶點(diǎn)。但是實(shí)體瘤的異質(zhì)性是實(shí)體腫瘤更為突出的特點(diǎn)之一，這也意味著即使是同一位患者一個(gè)部位的腫瘤也并非均表達(dá)相同的腫瘤相關(guān)性抗原。即使在一個(gè)腫瘤病灶上，無一種靶抗原可以覆蓋全部的腫瘤細(xì)胞。

2、實(shí)體瘤浸潤問題

第二，CAR-T對(duì)于實(shí)體瘤的浸潤問題。血液環(huán)境是一種勻質(zhì)的環(huán)境，不存在CAR-T的浸潤問題。而實(shí)體瘤則具有纖維組織的腫瘤屏障，且屏障內(nèi)部腫瘤微環(huán)境是一種低PH、低氧、低營養(yǎng)、高滲透壓的環(huán)境，不利于CAR-T細(xì)胞的浸潤激活增殖。

另外腫瘤高內(nèi)皮小靜脈（HEV），人體正常T細(xì)胞浸潤發(fā)炎或者病變組織的方式是通過扁平的毛細(xì)血管進(jìn)行HEV變化。T細(xì)胞通過HEV的表皮細(xì)胞定位并浸潤組織。在腫瘤晚期，腫瘤細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子損害HEV表皮細(xì)胞，因此腫瘤組織的形成的血管缺少表皮細(xì)胞，無法成為成熟的HEV血管。不成熟的HEV血管導(dǎo)致了T細(xì)胞的浸潤能力下降。

3、腫瘤微環(huán)境

第三，免疫抑制的腫瘤微環(huán)境。實(shí)體瘤微環(huán)境中，不僅有TGF-β等免疫抑制因子，腫瘤細(xì)胞表面也會(huì)表達(dá)多種免疫抑制信號(hào)。另外，腫瘤微環(huán)境中還有Treg等免疫抑制調(diào)控細(xì)胞，CAR-T在進(jìn)入腫瘤微環(huán)境之后，收到多種免疫抑制信號(hào)的調(diào)控，抑制其活性。

1、靶點(diǎn)選擇

不像血液瘤中CD19表達(dá)于所有B細(xì)胞表面，實(shí)體瘤的抗體選擇更為復(fù)雜。常見的實(shí)體瘤靶點(diǎn)有HER2，CEA，EGFR，GD2，PSMA，Mesothelin,MUC1等都是腫瘤相關(guān)性靶點(diǎn)，在腫瘤中高表達(dá)，在正常組織中也有少量的表達(dá)。比如HER2靶點(diǎn)廣泛出現(xiàn)在乳腺癌中，但是在正常的心肺組織中，也有少量表達(dá)。曾有有患者接受了靶向HER2的CAR-T治療，在5天之后，因?yàn)镃AR-T誘導(dǎo)的心肺功能衰竭而死亡。實(shí)體瘤靶點(diǎn)有EGFR/EGFRvIII，HER2，CEA，MSLN，F(xiàn)AP，cMet，GPC3，GD2，MUC1，L1-CAM等。

表2 CAR-T實(shí)體瘤靶點(diǎn)

資料來源：Nature,公開資料

表3 各個(gè)實(shí)體瘤靶點(diǎn)在腫瘤組織和正常組織中的表達(dá)情況

小結(jié)：

從上表來看，除了GPC3之外，其他蛋白抗原都存在與人體正常組織中，因此控制CAR-T的on-target毒性成為非常關(guān)鍵的因素。根據(jù)臨床推進(jìn)來看，可以關(guān)注MSLN，GPC3以及新型腫瘤特異性靶點(diǎn)在臨床上的進(jìn)展。

2、CAR-T的浸潤及微環(huán)境克服策略：

在找到靶點(diǎn)后，CAR-T如何找到實(shí)體瘤并且浸潤發(fā)揮作用又是另一難題。一是腫瘤血管不成熟，扭曲導(dǎo)致在實(shí)體瘤內(nèi)部幾乎沒有T細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)。因此一些血管形成的靶點(diǎn)如VEGF聯(lián)合CAR-T的治療會(huì)幫助CAR-T的浸潤。

另外，CAR-T的定位需要一些炎癥因子如CCL2，而腫瘤細(xì)胞很少釋放這類因子，曾有臨床前試驗(yàn)在動(dòng)物模型中用攜帶CCL2基因的牛痘病毒去感染腫瘤細(xì)胞，在感染后腫瘤周圍發(fā)現(xiàn)了許多CAR-T細(xì)胞被招募。

最后腫瘤表面有一層纖維組織，這層組織成為了腫瘤的物理屏障。有一個(gè)方法是使CAR-T細(xì)胞同時(shí)表達(dá)乙酰肝素酶，通過乙酰肝素酶降解腫瘤的纖維化細(xì)胞外基質(zhì)，克服物理屏障。

實(shí)體瘤內(nèi)部會(huì)產(chǎn)生多種免疫抑制的信號(hào)，如PD-L1高表達(dá)，TGF-β等免疫抑制因子，這些免疫抑制環(huán)境會(huì)抑制Car-T發(fā)揮其效用。在技術(shù)發(fā)展過程中，攜帶炎癥因子或者PD-1敲減的CAR-T產(chǎn)品逐漸出現(xiàn)。在2018年，上海普珩生物技術(shù)有限公司宣布，用于治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌的兩個(gè)新型腫瘤酸性微環(huán)境激活CAR-T產(chǎn)品臨床試驗(yàn)信息正式公布在clinicaltrials.gov上。這款CAR-T利用腫瘤內(nèi)部原本具有抑制作用的酸性環(huán)境激活，既解決了腫瘤內(nèi)部的酸性環(huán)境抑制，又解決了CAR-T的脫靶毒性問題。

但是這些方法在臨床上的驗(yàn)證相對(duì)較少，臨床階段處于早期而且樣本量較小。另外并沒有某種方式呈現(xiàn)出巨大的療效，實(shí)體瘤CAR-T的發(fā)展還有很長一段路要走。

表4 采用不同策略下的實(shí)體瘤CAR-T臨床試驗(yàn)

 

目前，幾家大型的CAR-T療法公司對(duì)實(shí)體瘤的布局有限，諾華和Bluebird的CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品在實(shí)體瘤也只有較少布局，吉利德科學(xué)雖然也沒有，但有一個(gè)探索性的TCR研究，國外多以研究所機(jī)構(gòu)布局為主。

表5 國際上獲得實(shí)體瘤CAR-T臨床批件的機(jī)構(gòu)

表6 國內(nèi)獲得實(shí)體瘤CAR-T臨床批件的企業(yè)          

小結(jié)：

可以看到實(shí)體瘤CAR-T的進(jìn)展還處于比較早期階段，絕大多數(shù)臨床還處于早期的臨床階段，樣本量較少。通過基因編輯“武裝”CAR-T和條件激活CAR-T成為主流嘗試方向。從上述臨床數(shù)據(jù)來看，Atara針對(duì)MSLN靶點(diǎn)治療多線耐藥后的乳腺癌，入組27人緩解率達(dá)到50%以上，治療效果和樣本量都不錯(cuò)。

國外可以關(guān)注諾華，Juno等大藥企的動(dòng)向，國內(nèi)可以關(guān)注科濟(jì)生物的進(jìn)展。科濟(jì)生物是國內(nèi)CAR-T實(shí)體瘤治療的領(lǐng)軍企業(yè)，其創(chuàng)新靶點(diǎn)CLDN18.2治療胃癌也達(dá)到了33.3%的ORR，值得關(guān)注。

CAR-T的產(chǎn)業(yè)化存在兩個(gè)關(guān)鍵性的環(huán)節(jié)，一是用于制備CAR-T的CAR的慢病毒載體；二是CAR-T產(chǎn)品的制備，儲(chǔ)存，質(zhì)量控制工藝。Kite花了將近1年的時(shí)間將CAR-T產(chǎn)品的制備出廠時(shí)間從10-12天降低為6-9天。由此可見CAR-T的制備工藝具有較高的壁壘。目前自體回輸型CAR-T的GMP工藝流程如圖四所示。可以看到CAR-T的制備工藝階段繁多，并且由于細(xì)胞產(chǎn)品極易被污染，環(huán)節(jié)與環(huán)節(jié)之間的過渡需要在封閉的環(huán)境下進(jìn)行。諾華采用的措施是通過自動(dòng)化或者半自動(dòng)化的系統(tǒng)減少污染的幾率。

自體回輸?shù)腃AR-T制備工藝經(jīng)過：T細(xì)胞采集及儲(chǔ)存-T細(xì)胞的富集-T細(xì)胞激活-T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)修飾-T細(xì)胞擴(kuò)增-成品CAR-T儲(chǔ)存等。質(zhì)量控制和檢測(cè)環(huán)節(jié)貫穿整條工藝線。在整個(gè)工藝流程中，有幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)和關(guān)鍵指標(biāo)需要注意。以下分析的基礎(chǔ)為已上市的兩款CAR-T產(chǎn)品和中國食品藥品檢定研究院發(fā)布的CAR-T的生產(chǎn)考慮要點(diǎn)。

圖7 CAR-T的GMP工藝流程 

T細(xì)胞采集純化：

也即 T 細(xì)胞的獲取 一般為從血液中分離純化 而純化的方法也可以分成培養(yǎng)過程中調(diào)整培養(yǎng)基進(jìn)行選擇和直接磁珠法分選等手段與企業(yè)整個(gè) T 細(xì)胞 處理的思路有關(guān) 需要全面考察其 技術(shù)路線和分離的純度、收獲率、活細(xì)胞率等。

轉(zhuǎn)染 ：

轉(zhuǎn)染環(huán)節(jié) 最直觀的指標(biāo)為轉(zhuǎn)染效率 （陽性率諾華為 50%，國內(nèi)企業(yè)從 20%-80%不等，但過高可能意味著 CAR 基因啟動(dòng)子強(qiáng)度過高或者病毒使用過多，存在致癌風(fēng)險(xiǎn)，因此追高無意義，只要滿足使用所需的細(xì)胞絕對(duì)量即可。

T細(xì)胞擴(kuò)增：

細(xì)胞培養(yǎng)是比較成熟的環(huán)節(jié)，但也是比較考驗(yàn)企業(yè)工藝的環(huán)節(jié)，培養(yǎng)基、生長因子、細(xì)胞因子等的選擇和操作規(guī)程都比較重要。細(xì)胞因子等的選擇和操作規(guī)程都比較重要。此環(huán)節(jié)主要指標(biāo)為擴(kuò)增時(shí)間和倍數(shù)指標(biāo)為擴(kuò)增時(shí)間和倍數(shù)，國內(nèi)和國外都將擴(kuò)增時(shí)間控制在1-2周，擴(kuò)增倍數(shù)在100倍左右。

回輸：

血液瘤CAR-T 一般按每公斤體重約106的細(xì)胞量進(jìn)行回輸 但也要參考患者的具體情況 。對(duì)實(shí)體瘤而言 直接在腫瘤部位給藥并不能提高治療效果，但有報(bào)道稱在腫瘤部位植入含 CAR-T 細(xì)胞的微型裝置并緩釋細(xì)胞因子進(jìn)行持續(xù)刺激可以提高對(duì)實(shí)體瘤的效果，需要驗(yàn)證。

總結(jié)來看，目前CAR-T工業(yè)化存在的難點(diǎn)有如下幾點(diǎn)：

1、自體回輸型CAR-T需要根據(jù)個(gè)體差異提取細(xì)胞，提取的原材料的細(xì)胞數(shù)量，活性，細(xì)胞亞群比例均不同，需要標(biāo)準(zhǔn)化的通用型CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，但是現(xiàn)在UCAR-T的安全性依然存疑。

2、傳統(tǒng)CAR-T生產(chǎn)需要病毒載體，病毒載體的質(zhì)量將直接影響后續(xù)CAR-T生產(chǎn)中的轉(zhuǎn)染效率和安全性問題。其他轉(zhuǎn)染方式制備CAR-T的技術(shù)還不成熟。

3、CAR-T的制備工藝步驟繁多，質(zhì)量控制耗費(fèi)巨大。整條產(chǎn)線各個(gè)環(huán)節(jié)要求盡量減少在外界的暴露，國外CAR-T的產(chǎn)線構(gòu)建是以半自動(dòng)化或全自動(dòng)化為標(biāo)準(zhǔn)，目前國內(nèi)已有的CAR-T產(chǎn)線還未達(dá)到半自動(dòng)化標(biāo)準(zhǔn)。

4、CAR-T的產(chǎn)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)還不成熟。

實(shí)體瘤CAR-T企業(yè)投資邏輯除了關(guān)注產(chǎn)業(yè)化制備工藝，成本問題，產(chǎn)品安全性，研發(fā)進(jìn)度及團(tuán)隊(duì)之外，更要關(guān)注如何解決實(shí)體瘤CAR-T的三大難點(diǎn)，并且要關(guān)注臨床前和臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。

1、產(chǎn)品靶點(diǎn)選擇

2、腫瘤微環(huán)境的克服

3、浸潤問題，并且關(guān)注相關(guān)臨床前和臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

目前已有的策略：

一是讓CAR-T攜帶并表達(dá)各種各樣的免疫因子，分泌PD-1抗體或者是PD-1敲除的CAR-T等。

二是使CAR-T進(jìn)行條件激活，在TME環(huán)境下特異性激活CAR-T。

三是多方案聯(lián)合治療。

CAR-T實(shí)體瘤上的進(jìn)展還相對(duì)處于早期，這些想法還沒有在臨床上得到大數(shù)據(jù)樣本的驗(yàn)證。